جداسازی آسپرژیلوس های مولد آفلاتوکسین از خاک باغات پسته و شناسایی و طبقه بندی آنها با استفاده از روش های ملکولی

در تحقیق حاضر، تعداد 100 نمونه خاک باغات پسته از 4 منطقه جغرافیایی مختلف در شهر دامغان از نظر حضور قارچ های مولد آفلاتوکسین از دسته فلاوی مورد ارزیابی قرار گرفتند. نمونه های خاک با استفاده از روش های استاندارد آماده سازی و در محیط های کشت جداسازی شامل دی کلران رزبنگال کلرامفنیکل آگار (drbc) و آسپرژیلوس فلاووس و پارازیتیکوس آگار (afpa) کشت داده شدند. کلنی های سبز- زرد بر روی drbc و پشت نارنجی برروی afpa از طریق پاساژ برروی محیط سابورو دکستروز آگار واجد کلرامفنیکل (sc) خالص سازی شده و از طریق بررسی ویژگی های مورفولوژی ماکروسکوپی و میکروسکوپی در سطح گونه شناسایی گردیدند. توانایی تولید آفلاتوکسین ایزوله ها با استفاده از روش کشت در نوک سمپلر (tip culture method) در محیط عصاره مخمر- سوکروز (yes) مورد ارزیابی قرار گرفت. محیط های کشت ایزوله ها پس از اتمام دوره 4 روزه انکوباسیون در دمای 28 درجه سانتی گراد جداسازی گردید و تولید آفلاتوکسین از طریق نمونه گذاری بر روی ژل سیلیکا به روش کروماتوگرافی لایه نازک (tlc) مورد ارزیابی کیفی قرار گرفت. تعداد 24 ایزوله منتخب در محیط yes در ارلن کشت داده شده و میزان تولید آفلاتوکسین در آنها با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (hplc) مورد سنجش قرار گرفت. تنوع ژنتیکی و طبقه بندی ایزوله های منتخب با استفاده از روش آنالیزdna چند شکل تکثیر شده تصادفی (rapd) بر روی نمونه های dna ژنومی مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج بدست آمده، تعداد 193 ایزوله از دسته فلاوی از خاک جداسازی شدند که همگی با توجه به ویژگی های مورفولوژیک و الگوی تولید آفلاتوکسین تحت عنوان آسپرژیلوس فلاووس شناسایی شدند. از میان 193 ایزوله آسپرژیلوس فلاووس، 114 ایزوله (07/59 درصد) مولد آفلاتوکسین بودند که در این میان، 104 ایزوله قادر به تولید آفلاتوکسین b1و 10 ایزوله قادر به تولید آفلاتوکسین b1 و b2 بودند. میزان تولید آفلاتوکسین b1 توسط 24 ایزوله منتخب آسپرژیلوس فلاووس در محدوده 25/1 تا 56/321 میکروگرم به ازای هر گرم وزن خشک قارچ گزارش گردید. بر اساس آنالیز rapd میزان قرابت ایزوله های آسپرژیلوس فلاووس جداسازی شده از نمونه های خاک با سویه استاندارد آسپرژیلوس فلاووس cmi 102566 بین 42 تا 87 درصد، با سویه استاندارد آسپرژیلوس فلاووس cmi 93803 بین 42 تا 86 درصد و با سویه استاندارد آسپرژیلوس فلاووس nrrl 3537 بین 11 تا 18 درصد بود. در مجموع نتایج به دست آمده در تحقیق حاضر نشان داد که آسپرژیلوس های مولد آفلاتوکسین متعلق به دسته فلاوی در نمونه های خاک باغات پسته ایران حضور دارند و می توانند از طریق جریان هوا در محیط پراکنده شده و محصولات کشاورزی و فرآورده های غذایی را در مراحل مختلف آلوده سازند. بدین این ترتیب ضرورت انجام تحقیقات گسترده در خصوص یافتن روش های مناسب برای مهار تولید آفلاتوکسین در قارچ مولد و ایجاد واریته های مقاوم گیاهی در مقابل آلودگی به این قارچ ها در آینده اجتناب ناپذیر خواهد بود. همچنین با توجه به کارآمدی روش های مولکولی در شناسایی و طبقه بندی قارچ ها و نقش اجتناب ناپذیر آسپرژیلوس های مولد آفلاتوکسین در بهداشت عمومی، تحقیقات مولکولی آینده بر روی بررسی بیان ژن های مسیر بیوسنتز آفلاتوکسین به منظور تفریق قارچ های مولد آفلاتوکسین از غیر مولد متمرکز خواهد بود.